تحليل PCR أو(تفاعل البلمرة المتسلسل)، هو تقنية تستخدم في المختبر لصنع ملايين النسخ لقسم معين من الحمض النووي، ولقد تم تطويره لأول مرة في 1980 ،و الـ PCR هو واحد من ضمن التحليلات الخاصة بإلتهاب الكبد
ماهو تحليل pcr ؟
تم تطوير تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) في الأصل في عام 1983 من قبل عالم الكيمياء الحيوية الأمريكي كاري موليس، ولقد حصل على جائزة نوبل في الكيمياء في عام 1993 لعمله الرائد.
إستخدامات تحليل pcr :
- يستخدم PCR في البيولوجيا الجزيئية لعمل نسخ عديدة من (تضخيم) أقسام صغيرة من الحمض النووي؟ أو جين؟
- باستخدام PCR ، من الممكن توليد آلاف إلى ملايين النسخ من قسم معين من الحمض النووي من كمية صغيرة جدًا من الحمض النووي.
- PCR هو أداة شائعة تستخدم في مختبرات الأبحاث الطبية والبيولوجية. يتم استخدامه في المراحل المبكرة من معالجة الحمض النووي للتسلسل؟ ، لاكتشاف وجود أو عدم وجود جين يساعد على تحديد العوامل المسببة للأمراض أثناء العدوى ، وعند توليد صور الحمض النووي الشرعي من عينات دقيقة من الحمض النووي.
- هو واحد من ضمن التحليلات الخاصة بإلتهاب الكبد
كيف يعمل PCR؟
- إن المبادئ وراء كل PCR ، بغض النظر عن عينة الحمض النووي ، هي نفسها.
- مطلوب خمسة “المكونات” الأساسية لإعداد PCR. سنشرح بالضبط ما يفعله كل واحد من هؤلاء عندما نذهب. هؤلاء هم:
- قالب الحمض النووي المراد نسخها
- الاشعال ، وتمتد قصيرة من الحمض النووي التي تبدأ تفاعل البلمرة المتسلسل ، مصممة لربط أي من جانبي قسم الحمض النووي الذي تريد نسخه
- قواعد النيوكليوتيد الحمض النووي؟ (المعروف أيضا باسم dNTPs). قواعد الحمض النووي (A ، C ، G و T) هي لبنات بناء الحمض النووي ، وهناك حاجة لبناء خيط جديد من الحمض النووي
- انزيم بوليميريز طق؟ لإضافة في قواعد الحمض النووي الجديد
- عازلة لضمان الظروف المناسبة للتفاعل.
- PCR ينطوي على عملية التدفئة والتبريد تسمى الدراجات الحرارية التي تتم بواسطة آلة.
ثلاث مراحل رئيسية في تحليل pcr:
تغيير طبيعة – عندما يتم تسخين الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل قالب لفصله إلى اثنين من فروع واحدة.
التلدين – عندما تنخفض درجة الحرارة لتمكين بادئات الدنا من الارتباط بنموذج DNA.
توسيع – عندما يتم رفع درجة الحرارة ويتم إجراء خيط جديد من الحمض النووي بواسطة انزيم بوليميريز طق.
- تتكرر هذه المراحل الثلاث 20-40 مرة ، مما يضاعف عدد نسخ ال د ن ا في كل مرة.
- يمكن إجراء تفاعل PCR كامل في غضون بضع ساعات ، أو حتى أقل من ساعة مع بعض الآلات عالية السرعة.
- بعد الانتهاء من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يمكن استخدام طريقة تسمى الرحلان الكهربائي للتحقق من كمية وحجم شظايا الحمض النووي المنتجة.
ماذا يحدث في كل مرحلة من مراحل تحليل pcr ؟
مرحلة عدم التشويش (Denaturing stage )
- خلال هذه المرحلة يتم تسخين الكوكتيل الذي يحتوي على قالب الحمض النووي وجميع المكونات الأساسية الأخرى إلى 94-95 درجة مئوية.
- درجة الحرارة المرتفعة تسبب الروابط الهيدروجينية؟ بين القواعد في اثنين من فروع قالب الحمض النووي لكسر وشريطين للفصل.
- وينتج عن هذا سلالتين مفردتين من الحمض النووي ، والتي ستعمل كنماذج لإنتاج خيوط الدنا الجديدة.
- من المهم الحفاظ على درجة الحرارة في هذه المرحلة لفترة كافية للتأكد من فصل خانات الدنا بالكامل.
هذا عادة ما يستغرق ما بين 15-30 ثانية.
مرحلة التلدين (Annealing stage) :
- خلال هذه المرحلة يتم تبريد التفاعل إلى 50-65 درجة مئوية. وهذا يمكّن البرايمرات من الالتصاق بموضع معين على الحمض النووي الأحادي الجديلة عن طريق الترابط الهيدروجيني (تعتمد درجة الحرارة الدقيقة على درجة حرارة ذوبان البادئات التي تستخدمها).
الاشعال
- هي فروع واحدة من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي؟ التسلسل الذي يتراوح من 20 إلى 30 قاعدة.
- تم تصميم الاشعال لتكون مكملة؟ في تسلسل لأقسام قصيرة من الحمض النووي في كل نهاية التسلسل المراد نسخها.
- الاشعال بمثابة نقطة انطلاق لتخليق الحمض النووي. يمكن أن يضيف إنزيم البوليمريز فقط قواعد الحمض النووي إلى خيط مزدوج من الحمض النووي. مرة واحدة فقط قد ترتبط في التمهيدي يمكن للإنزيم البوليمرية نعلق والبدء في جعل الحزام التكميلي الجديد من الحمض النووي من قواعد الحمض النووي فضفاضة.
- تكون سلتان الحمض النووي المنفصلتان متكاملين ويتم تشغيلهما في اتجاهين متعاكسين (من نهاية واحدة – الطرف 5 – إلى الطرف الآخر – الطرف 3) ؛ ونتيجة لذلك ، هناك نوعان من البرايمر – أساس التمهيدي ورائع التمهيدي.
هذه الخطوة تستغرق عادة حوالي 10-30 ثانية.
تمديد المرحلة (Extending stage) :
- خلال هذه الخطوة النهائية ، يتم زيادة الحرارة إلى 72 درجة مئوية لتمكين إجراء الحمض النووي الجديد بواسطة إنزيم بوليميراز DNA Taq الخاص الذي يضيف قواعد الحمض النووي.
- طم DNA بوليميراز هو إنزيم مأخوذ من البكتريا المحبة للحرارة؟ Thermus aquaticus.
- تعيش هذه البكتيريا عادة في الينابيع الساخنة لذلك يمكن أن تتحمل درجات حرارة أعلى من 80 درجة مئوية.
- إن بوليميراز الحمض النووي البكتيري مستقر جدًا عند درجات الحرارة المرتفعة ، مما يعني أنه يمكنه تحمل درجات الحرارة اللازمة لكسر فروع الحمض النووي في مرحلة عدم التغير في تفاعل البلمرة المتسلسل.
- إن بوليميراز الحمض النووي (DNA) من معظم الكائنات الحية الأخرى لن يكون قادرا على تحمل درجات الحرارة المرتفعة هذه ، على سبيل المثال ، تعمل البلمرة البشرية بشكل مثالي عند 37 درجة مئوية (درجة حرارة الجسم).
- 72 درجة مئوية هي درجة الحرارة المثلى لبوليميراز طق لبناء حبلا التكميلية. يعلق على التمهيدي ثم يضيف قواعد الحمض النووي إلى حبلا واحد تلو الآخر في اتجاه 5 إلى 3.
- والنتيجة هي سلسلة جديدة من الحمض النووي وجزيء من الحمض النووي المزدوج الجديلة.
- تعتمد مدة هذه الخطوة على طول تسلسل DNA الذي يتم تضخيمه ولكن عادة ما يستغرق حوالي دقيقة واحدة لنسخ 1000 قاعدة DNA (1Kb).
- تتكرر هذه العمليات الثلاث للدراجات الحرارية 20-40 مرة لإنتاج الكثير من نسخ تسلسل الحمض النووي للمصلحة.
- كما أن الأجزاء الجديدة من الدنا التي يتم إجراؤها أثناء تفاعل البوليميراز التسلسلي تعمل أيضًا كنماذج يمكن أن يربطها إنزيم بوليميريز الدنا وتبدأ في تصنيع الحمض النووي.
والنتيجة هي عدد ضخم من نسخ جزء DNA المحدد الذي تم إنتاجه في فترة زمنية قصيرة نسبيًا.